Однако сибирские биологи только что доказали: прорывы еще возможны. Сотрудникам Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) впервые в мире удалось получить структуру человеческого белка NEIL2 (гликозилазы), отвечающего за репарацию поврежденных оснований ДНК. Исследование проводилось в рамках гранта РНФ «Система геномного редактирования на основе эндонуклеазы Cas9: структурные факторы узнавания целевых ДНК». За сугубо фундаментальным названием скрывается широкое практическое применение результатов открытия, поскольку сегодня молекулярная биология вплотную приблизилась к персонализированной медицине. Комментирует руководитель проекта, заместитель директора ИХБФМ СО РАН по научной работе Владимир КОВАЛЬ:
– В последние годы биология вплотную подошла к предсказанию и предотвращению болезней, не переставая быть наукой фундаментальной. Недаром ренессанс интереса к структурной биологии возник лет пять назад в связи с тем, что геном человека достаточно хорошо изучен, пришла пора заниматься протеомом (совокупность белков организма) и метаболомом (совокупность малых молекул в клетке). Сейчас многие заболевания, в том числе врожденные, диагностируются по нарушениям в метаболическом профиле (такой профиль дает как бы мгновенный снимок физиологических процессов в клетке). Установив структуру белка, можно выяснить его функции в организме, а затем исследователи предлагают дизайн лекарственных средств, основанный на этом знании, им теперь не нужно перебирать сотни тысяч химических соединений. Благодаря структурной биологии практически удалось победить вирусные гепатиты C и B. А в качестве самого актуального примера лекарств, основанных на подавлении физиологических процессов, могу привести два ингибитора протеазы коронавируса 3CL, разработанные компаниями Pfizer и Merck. Эти лекарства, уже применяемые во многих странах, позволяют достаточно эффективно подавить пролиферацию вируса в клетках, а иммунная система организма легко «добивает» те частицы SARS-CoV-2 (так сегодня именуется возбудитель COVID-19), которые успели проникнуть в организм.
Вспоминая историю института, Владимир Васильевич выделяет два основных направления, возникших еще в те годы, когда будущий ИХБФМ СО РАН был отделом НИОХ СО РАН: химия нуклеиновых кислот и исследование структуры белковых ансамблей, функций различных ферментов, белков, белково-нуклеиновых комплексов. Белковыми ансамблями в институте успешно занимаются несколько лабораторий, достигших мировой известности. Помимо того что исследования структур таких ансамблей интересны с фундаментальной точки зрения, они позволяют, как уже говорилось, выявить новые функции белков и выяснить, можно ли на них влиять. Учитывая существенно расширившийся набор инструментов для исследования, руководство ИХБФМ СО РАН решило, что разумнее всего будет использовать их коллективно, и в 2014 году в институте был создан Объединенный центр геномных, протеомных и метаболомных исследований.
– Наш центр решает задачи секвенирования геномов, определяет модификации белков, выявляет их в качестве маркеров каких-то заболеваний, исследует естественные и неестественные для организма метаболиты (к последним относится, например, скорость накопления лекарственных средств в организме), – поясняет руководитель Объединенного центра Владимир Коваль. – Мы стали своего рода хабом исследования малых молекул будущих лекарств для многих институтов СО РАН, где хорошо развита разработка новых фармпрепаратов. Ученым интересно не просто узнать концентрацию лекарств в организме, а изучить более подробно, как происходит накапливание и превращение лечебных средств. Сейчас ведем большую работу для ГНЦ ВБ «Вектор», где испытывают лекарство от черной оспы. К сожалению, эта страшная болезнь не исчезла с лица Земли навсегда, как считалось. Есть исследования коммерческого плана: скажем, фармацевтическая компания хочет понять, как поменять технологические процессы, чтобы улучшить препарат. Такое исследование мы проводим, в частности, для новосибирской фирмы ПФК «Обновление». И, наконец, бывают задачи чисто криминалистические: обращаются следственные органы с просьбой установить, какому виду осетровых рыб из какого бассейна принадлежит найденная икра или какое животное было обладателем конфискованного у браконьеров меха.
Не удивляйтесь, читатель, криминалистика имеет достаточно прямое отношение к упомянутому в начале статьи фундаментальному прорыву. Во-первых, именно обилие грантов Российского научного фонда у лабораторий ИХБФМ СО РАН (более десятка за последние годы) позволило проводить планомерное обновление приборной базы. В рамках этого обновления в декабре 2019 года был закуплен установленный в Объединенном центре геномных, протеомных и метаболомных исследований современный масс-спектрометр высокого разрешения с романтическим названием «Орбитальная ионная ловушка» (Orbitrap), на котором и была расшифрована структура белка NEIL2. Во-вторых, само открытие гликозилазы человека двадцать лет назад привело, можно сказать, к загадкам почти детективным.
Красивая легенда о том, что, расшифровав геном человека, ученые поймут причины болезней и смогут на них влиять, жила в научном мире ровно до 2002 года, то есть до расшифровки генома. Оказалось, что белков в клетке не так много – 25-30 тысяч вместо предполагаемых 100-150 – но существуют их разные модификации, иногда кардинально меняющие функции. Словом, ограниченное количество белков дает несметное множество вариаций.
– С каждого гена считывается белок, и понять, какую структуру этот белок имеет, какую функцию несет, какими регуляторными возможностями обладает, – многоплановая задача для исследователя, – комментирует Владимир Васильевич. – Человек – настоящая химическая фабрика: в организме есть малые молекулы, нейромодуляторы, молекулы, которые могут превращаться и давать нам энергию. И работу этой фабрики нам только предстоит изучить. Открытие человеческой гликозилазы – хороший тому пример.
Вскоре после расшифровки генома человека ученые Йельского университета (США) обнаружили в нем белки, очень похожие по последовательности аминокислот на бактериальные гликозилазы. Исследователи клонировали геном в бактерии, наработали белок, выделили и стали изучать его специфичность по отношению к различным субстратам. Поскольку было известно, что гликозилаза отвечает за «ремонт» оснований ДНК, то в эксперименте использовали поврежденную нуклеиновую кислоту. Так выяснилось, что белки NEIL1, NEIL2, NEIL3 являются белками репарации. Открытие произвело фурор среди научной общественности и породило массу вопросов: до того считалось, что биологи знают все белки репарации. Зачем в клетке имеются еще три?
Причем NEIL2 оказался крепким орешком для «разгрызания»: за 20 лет ученым так и не удалось расшифровать его структуру. Дело в том, что белок состоит из двух доменов, соединенных подвижным элементом, и кристаллизовать его для разрешения структуры не удается. Ближе всех к решению задачи подошла два года назад группа американских исследователей, проанализировавшая целый пул ферментов NEIL2 из разных живых организмов. Они смогли расшифровать структуру белка виргинского опоссума, распространенного в ряде штатов Америки в качестве домашнего животного. Структуру белка опоссума удалось кристаллизовать, поскольку у него отсутствует пресловутый вариабельный домен. Стало ясно, что на очереди – разгадка человеческой гликозилазы.
Хотя масс-спектрометрия ведет историю с начала XX века, в биологии ее стали применять лишь с 1984 года. Какова традиционная процедура определения структуры белка? Синтезируют белок, выделяют его, очищают, затем кристаллизуют и из кристалла получают структуру. NEIL2, как уже упоминалось, кристаллизации не поддавался.
– Другой путь, позволяющий расшифровать структуру, – метод, которым в России владеет только наша исследовательская группа: замена в белке водорода на дейтерий, что позволяет исследовать структуры белков в растворе, – рассказывает Владимир Коваль. – Этот метод давно используют ЯМР-спектроскописты, поскольку в молекуле белка достаточно много ионов водорода. Заменяя его на дейтерий, который в два раза тяжелее, мы можем «пометить» молекулу, при этом ее физические и химические свойства не изменятся. Применение HDX-MS-метода позволяет получить трехмерную структуру белка, который не кристаллизуется. Но метод не так широко применяется – в мире всего несколько групп его используют, в России – только мы. Масс-спектрометр Orbitrap дал недостающие технические возможности, и за год нам удалось сделать хорошее, качественное исследование. Статья о расшифровке структуры человеческого белка репарации NEIL2 была опубликована в Journal of Molecular Biology. Работа, которой можно гордиться. Не могу не отметить еще один важный момент: Российский научный фонд неукоснительно требует, чтобы в грантах участвовали студенты и аспиранты. Нашему, можно сказать, молодежному институту такое требование выполнять легко и приятно. И политика РНФ дает плоды: первым в списке авторов статьи о мировом открытии стоит имя аспирантки Полины Ждановой.
В ближайшее время ученые планируют продолжить изучение белка NEIL2, в частности, установить, насколько его свойства зависят от структуры. Специалисты ИХБФМ СО РАН убеждены: в результате реализации проекта РНФ будут получены важные фундаментальные знания об основах процессов, обеспечивающих защиту ДНК и позволяющих точечно редактировать геном. Будет развиваться и новый подход к изучению сложных надмолекулярных комплексов – масс-спектрометрия, основанная на водородно-дейтериевом обмене (уже упомянутый метод HDX-MS). Более того, Владимир Коваль надеется, что открытие его команды даст толчок отечественным исследованиям в области структурной биологии. И здесь неоценимую помощь может оказать Сибирский кольцевой источник фотонов (СКИФ) – синхротрон нового поколения, строящийся под Новосибирском.
– Наш институт создает пользовательскую станцию 1-6 «Микрофокус», которая должна быть запущена в первой очереди ЦКП «СКИФ», – поясняет Владимир Васильевич. – Биологи получат неоценимый подарок – возможность использовать в России метод макромолекулярной кристаллографии. Сейчас для прочтения кристаллической структуры белка нам приходится ездить за рубеж, что в последние годы крайне сложно, не говоря о научной тайне. Изучив структуру белка NEIL2, мы получили технологии, знания и компетенции, которые в дальнейшем сможем использовать для точного определения структуры других белковых комплексов, в том числе снимая «молекулярное кино» с помощью синхротронного излучения.
Планируют биологи развивать и другие методы молекулярной кристаллографии. Как показал пример с NEIL2, в нашем организме есть ряд белков, которые не кристаллизуются либо не поддаются выделению и растворению в воде. Используя синхротронное излучение, можно прочитать регулярную кристаллическую структуру, причем с высокой точностью. Однако в сложных случаях применяют криоэлектронный микроскоп. Такое оборудование позволяет исследовать так называемый «аморфный лед», в который можно превратить некристаллизующиеся белки. Точность меньше, чем у синхротрона, но координаты атомов получить позволяет. Микроскоп дорогой, его цена – свыше миллиарда рублей, однако гигантские белки (больше 100 килодальтон) можно изучать только с его помощью. И на зарубежных источниках СИ обязательно работает вспомогательная станция с криоэлектронным микроскопом. В.Коваль убежден: если мы планируем дальнейшие прорывы в структурной биологии, то стоит задуматься о подобных капиталовложениях.
