Они усовершенствовали экспресс-иммуноанализ, добившись большой точности диагностики для образцов с очень малой концентрацией биомаркера инфекции. Это позволит выявлять туберкулёз на самой начальной стадии, когда болезнь ещё явно не проявилась клинически. Результаты работы пущинских ученых опубликованы в журнале Analytica Chimica Acta.
Иммуноанализ много десятков лет применяют в медицине для определения инфекций. Этот метод основан на связывании антигенов – белков патогена с антителами – белками, которые образуются в организме в ответ на чужеродное вторжение. Стандартный иммуноанализ занимает 3 – 4 часа, а для визуализации связанных антител обычно используют флуоресцентные метки. Проблема в том, что для работы с образцами с низким содержанием антител у стандартного иммуноанализа не хватает чувствительности.
В лаборатории наноструктур и нанотехнологий ИТЭБ РАН под руководством Виктора Морозова несколько лет назад стали разрабатывать совершенно новый метод иммуноанализа, основанный на электрофорезе. Учёные создали уникальное оборудование и добились того, что анализ образца стал занимать считанные минуты. Для визуализации связывания молекул антител они использовали магнитные метки. В новой работе им удалось существенно повысить точность иммуноанализа, установив условия, при которых количество связанных с микрочипом магнитных меток линейно зависит от концентрации анализируемых антител.
На целлофановую мембрану учёные наносили пятна секретируемых антигенов туберкулёза и антител к этим антигенам. Получившийся микрочип они помещали в самодельное устройство для электрофореза (проточную ячейку) и пропускали через него плазму крови. Чтобы не ждать, пока молекулы антитела случайно наткнутся на антигены на микрочипе, учёные прикладывали электрическое поле в ячейке так, что отрицательно заряженные антитела смещались из потока в сторону мембраны и концентрировались на микрочипе. Таким образом связывание антител с антигенами происходило очень быстро. Далее через ячейку пропускали суспензию магнитных частиц, несущих антитела, которые также буквально за секунды связывались на микрочипе. Образцы анализировали под микроскопом, подсчитывая с помощью специального софта число магнитных частиц и сравнивая их с положительным контролем. Количественная оценка в иммуноанализе необходима, чтобы соотносить результаты с нормой и выявлять таким образом патологию.
«Раньше считалось, что вследствие сильной нелинейности калибровочной кривой при таком иммуноанализе, точные измерения концентрации невозможны. Мы обнаружил, что имеются условия, при которых сигнал зависит от концентрации исследуемого вещества линейно. Это верно для очень малых концентраций, где сигнал весьма мал», – рассказал пресс-службе ИТЭБ РАН соавтор статьи Юрий Шляпников.
На следующем этапе учёным предстоит приспособить свой метод для работы с образцами выдыхаемого воздуха, где содержатся микрокапли лёгочной жидкости. В таких образцах очень мало антител к туберкулёзу – фемтограммы. Стандартный иммуноанализ на таких концентрациях бесполезен. Конечная же цель работы – создать неинвазивный метод ранней диагностики туберкулёза лёгких, т.е. отличать человека, который начал заболевать туберкулёзом, от здорового человека.
«За сравнительно небольшое время мы надеемся довести этот метод до внедрения в практику», – подчеркнул Юрий Шляпников.
Созданный в ИТЭБ метод иммуноанализа можно будет применять для определения других инфекций, вызываемых различными стафилококками, холерным вибрионом, кишечной палочкой и другими патогенами. Он поможет в экстренных случаях, когда нужно срочно сделать анализ у человека с воспалением непонятной природы, чтобы как можно скорее начать правильное лечение. Особенно это важно в случае заражения бактериальной инфекцией, сопротивляющейся большинству антибиотиков широкого действия.
Разработку бесконтактного метода выявления туберкулеза учёных из ИТЭБ РАН поддержал Российский научный фонд. Проект осуществляется совместно с ЦНИИ туберкулеза в Москве (лаб. проф. И.В. Лядовой).
Источник:
Shlyapnikov, Yuri M., and Victor N. Morozov. «Titration of trace amounts of immunoglobulins in a microarray–based assay with magnetic labels». Analytica Chimica Acta (2017).
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267017302544
